“Penentuan Kadar Protein secara Lowry”

BAB I

PENDAHULUAN

1.1  Latar Belakang

Protein merupakan suatu polipeptida yang memiliki struktur primer, sekunder, tersier dan kuartener.  Penentuan konsentrasi protein merupakan proses yang rutin digunakan dalam kerja Biokimia.  Ada beberapa metode yang biasa digunakan dalam rangka penentuan konsentrasi preotein, yaitu metode Biuret, Lowry, dan lain sebagainya.  Masing-masing metode mempunyai kekurangan dan kelebihan.  Pemilihan metode yang terbaik dan tepat untuk suatu pengukuran bergantung pada beberapa faktor seperti misalnya, banyaknya material atau sampel yang tersedia, waktu yang tersedia untuk melakukan pengukuran, alat spektrofotometri yang tersedia (VIS atau UV).

Reagen pendeteksi gugus-gugus fenolik seperti reagen folin dan ciocalteu telah digunakan dalam penentuan konsentrasi protein oleh Lowry (1951) yang kemudian dikenal dengan metode Lowry.  Dalam bentuk yang paling sederhana reagen folin ciocalteu apat mendeteksi residu tirosin (dalam protein) karena kandungan fenolik dalam residu tersebut mampu mereduksi fosfotungsat dan fosfomolibdat, yang merupakan konstituen utama reagen folin ciocalteu, menjadi tungsten dan molibdenum yang berwarna biru.  Hasil reduksi ini menunjukkan puncak absorbsi yang lebar pada daerah merah. Sensitifitas dari metode folin ciocalteu ini mengalami perbaikan yang cukup signifikan apabila digabung dengan ion-ion Cu (Hermansyah, 2012).

1.2 Rumusan Masalah

Bagaiman cara untuk menentukan konsentrasi protein ?

1.3  Tujuan Percobaan

Dari percobaan ini diharapkan mahasiswa mampu menentukan konsentrasi protein dengan metode Lowry.

1.4 Manfaat Percobaan

Masyarakat mampu mengetahui dan memahami cara-cara pengukuran kadar protein dengan menggunakan metode Lowry. Metode Lowry digunakan dan dianggap cukup teliti untuk pengukuran kadar protein dalam bahan makanan. Metode ini dipercaya penuh oleh ahli farmakologi dalam menentukan kadar protein.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

Protein adalah sumber-sumber asam amino yang mengandung unsur C, H, O dan N yang tidak dimiliki oleh lemak atau karbohidrat.  Protein adalah makromolekul polipeptida yang tersusun dari sejumlah L-asam amino yang dihubungkan oleh ikatan peptida, berbobot molekul tinggi dari 5000 sampai berjuta-juta.  Protein terdiri dari bermacam-macam golongan, makro molekul yang heterogen, walaupun demikian semuanya merupakan turunan dari polipeptida dengan BM yang tinggi.  Unsur yang ada dalam hampir semua protein adalah hidrogen, oksigen, nitrogen, dan belerang. Ditinjau dari strukturnya, protein dibagi dalam dua golongan besar, yaitu golongan protein sederhana dan protein gabungan. Protein sederhana adalah protein yang hanya terdiri dari molekul-molekul asam amino, sedangkan protein gabungan adalah protein yang terdiri dari protein dan gugus bukan protein. 

Analisis protein dapat dilakukan dengan dua metode, yaitu secara kualitatif dan secara kuantitatif.  Analisis protein secara kualitatif terdiri atas reaksi Xantoprotein, reaksi Hopkins-Cole, reaksi Millon, reaksi Nitroprusida, dan reaksi Sakaguchi.  Sedangkan analisis protein secara kuantitatif terdiri dari metode Kjeldahl, metode titrasi formol, metode Lowry, metode spektrofotometri visible (Biuret), dan metode spektrofotometri UV (Poedjiadi, 2007).

Sifat protein jika dilarutkan dengan asam klorida dan enzim protease akan menghasilkan asam amino karboksilat.   Disisi lain protein dapat mengalami denaturasi yaitu perubahan struktur protein yang menimbulkan perubahan sifat fisika, kimia dan biologi bila  protein dipanaskan dapat mengakibatkan gelombang elektromagnetik tertentu contohnya  bisa, kokain kuman-kuman dan lain-lain.  Spektrofotometri merupakan suatu metoda analisa yang didasarkan pada pengukuran serapan sinar monokromatis oleh suatu lajur larutan berwarna pada panjang gelombamg spesifik dengan menggunakan monokromator prisma atau kisi difraksi dengan detektor fototube.

Spektrofotometer adalah alat untuk mengukur transmitan atau absorban suatu sampel sebagai fungsi panjang gelombang.  Sedangkan pengukuran menggunakan spektrofotometer ini, metoda yang digunakan sering disebut dengan spektrofotometri.  Spektrofotometer dapat mengukur serapan di daerah tampak, UV (200-380 nm) maupun IR (> 750 nm).  Monokromator pada spektrofotometer menggunakan kisi atau prisma yang daya resolusinya lebih baik sedangkan detektornyamenggunakan tabung penggandaan foton atau fototube.

Komponen utama dari spektrofotometer, yaitu sumber cahaya, pengatur Intensitas, monokromator, kuvet, detektor, penguat (amplifier), dan indikator. Spektrofotometri dapat dianggap sebagai perluasan suatu pemeriksaan visual dengan studi yang lebih mendalam dari absorbsi energi.  Absorbsi radiasi oleh suatu sampel diukur pada berbagai panjang gelombang dan dialirkan oleh suatu perkam untuk menghasilkan spektrum tertentu (Anwar, 1992).

Metode Spektrofotometer dengan untraviolet yang diserap bukan cahaya tampak cahaya ultra ungu (Ultraviolet).  Dalam Spektrofotometer ultra ungu energi cahaya tampak terserap digunakan untuk transfuse electron. Karena energi Cahaya Ultraviolet dapat menyebabkan transfuse elektron. Kebanyakan protein merupakan enzim atau subunit enzim.  Jenis protein lain berperan dalam fungsi struktural atau mekanis, seperti misalnya protein yang membentuk batang dan sendi sitoskeleton. Protein terlibat dalam sistem kekebalan (imun) sebagai antibodi, sistem kendali dalam bentuk hormon.

Beberapa zat yang bisa mengganggu penetapan kadar protein dengan metode Lowry ini, diantaranya buffer, asam nuklet, gula atau karbohidrat, deterjen, gliserol, Tricine, EDTA, Tris, senyawa-senyawa kalium, sulfhidril, disulfida, fenolat, asam urat, guanin, xanthine, magnesium, dan kalsium. Interferensi agen-agen ini dapat diminimalkan dengan menghilangkan interferens tersebut. Sangat dianjurkan untuk menggunakan blanko untuk mengkoreksi absorbansi. Interferensi yang disebabkan oleh deterjen, sukrosa dan EDTA dapat dieliminasi dengan penambahan SDS atau melakukan preparasi sampel dengan pengendapan protein (Kristiani, 2010).

Beberapa protein berisi unsur lain seperti besi yang terdapat dalam hemoglobin, iodium terdapat dalam thiroglobin dan fosfor terdapat dalam kasein.  Molekul protein sangat besar, masa molekulnya berkisar antara 10.000-25.000. oksihemoglobin dengan rumus molekul (C₇₈₃H ₁₁₆₆O₂₀₈N₂₀₃S₂Fe₄) mempunyai massa molekul kurang lebih 65.000.  Penyusun protein adalah asam amino, yaitu asam organik yang mengandung gugus amimo (-NH₂) disamping gugus karboksilat (-COOH).  Asam amino yang terdapat di alam selalu berupa asam amino alpa , artinya gugus - NH₂ selalu terikat pada atom C- alpa, yaitu atom C di dekat gugus –COOH (Lehninger, 1998).

Asam amino yang terdapat di alam selalu berupa asam amino alpa, artinya gugus -NH₂ selalu terikat pada atom C- alpa, yaitu atom C di dekat gugus –COOH.  Asam amino yang dikenal banyak sekali tetapi hanya 20 jenis yang termasuk penyusun protein alami.  Gugus R disebut gugus samping, gugus inilah yang membedakan sifat-sifat antara satu adam amino dengan asam amino lainnya, sedangkan gugus lainnya sama untuk semua asam amino.

Metode Lowry mengkombinasikan pereaksi biuret dengan pereaksi lain (Folin-Ciocalteauphenol) yang bereaksi dengan residu tyrosine dan tryptophan dalam protein. Reaksi ini menghasilkan warna kebiruan yang bisa dibaca di antara 500 - 750 nm, tergantung sensitivitas yang dibutuhkan.  Akan muncul puncak kecil di sekitar 500 nm yang dapat digunakan untuk menentukan protein dengan konsentrasi tinggi dan sebuah puncak besar disekitar 750 nm yang dapat digunakan untuk menentukan kadar protein dengan konsentrasi rendah.  Metode ini lebih sensitif untuk protein konsentrasi rendah dibanding metode biuret          (Soeharsono, 2006).

Protein dengan asam fosfotungsat-fosfomolibdad pada suasana alkalis akan memberikan warna biru yang intensitasnya bergantung pada konsentrasi protein yang ditera.  Untuk mengetahui banyaknya protein dalam larutan, terlebih dahulu dibuat kurva standar yang melukiskan hubungan antara konsentrasi dan optical dencity (OD).

Biasanya digunakan serum albumin.  Larutan Lowry ada dua macam yaitu larutan A yang terdiri dari fosfotungstat-fosfomolibdad (1:1) dan larutan Lowry B yang terdiri dari Na-carbonat 2% dalam NaOH 0,1 N, kupri sulfat dan Na-K-tartat 2%.  Cara penentuannya seperti berikut: 1 ml larutan protein ditambah 5 ml Lowry B, digojong dan dibiarkan selama 10 menit.  Kemudian ditambah 0,5 ml Lowry A digojong dan dibiarkan 20 menit.  Selanjutnya diamati OD-nya.

Metode Lowry merupakan pengembangan dari metode Biuret.  Dalam metode ini terlibat 2 reaksi.  Awalnya, kompleks Cu(II)-protein akan terbentuk sebagaimana metode biuret, yang dalam suasana alkalis Cu(II) akan tereduksi menjadi Cu(I). Ion Cu+ kemudian akan mereduksi reagen Folin-Ciocalteu, kompleks phosphomolibdat phosphotungstat (phosphomolybdotungstate), menghasilkan heteropoly molybdenum blue akibat reaksi oksidasi gugus aromatik (rantai samping asam amino) terkatalis Cu, yang memberikan warna biru intensif yang dapat dideteksi secara kolorimetri.

Berawal dari pemanfaatan alat spektrofotometer yaitu untuk mengukur jumlah penyerapan zat suatu senyawa.  Penyerapan cahaya pada senyawa larutan tersebut, dalam spektrofotometri dapat digunakan sebagai dasar atau pedoman dalam penentuan konsentrasi larutan atau senyawa secara kuantitatif.  Dalam pratikum ini penggunaan KMnO₄ bertujuan untuk memudahkan dalam pengenalan dan latihan awal spektrofotometri.  Kekuatan warna biru terutama bergantung pada kandungan residu tryptophan dan tyrosine-nya.  Keuntungan metode Lowry adalah lebih sensitif (100 kali) daripada metode Biuret (Sudarmaji, 1996).

Adapun uji yang lain yaitu Uji Biuret adalah uji umum untuk protein (ikatan peptida), tetapi tidak dapat menunjukkan asam amino bebas. Zat yang akan diselidiki mula-mula ditetesi larutan NaOH, kemudian ditetesi larutan tembaga(II) sulfat yang encer. Jika terbentuk warna ungu berarti zat itu mengandung protein. Uji Xantoproteat adalah uji terhadap protein yang mengandung gugus fenil (cincin benzena). Apabila protein yang mengandung cincin benzena dipanaskan dengan asam nitrat pekat, maka akan terbentuk kuning yang kemudian menjadi warna jingga bila dibuat alkalis(basa) dengan larutan NaOH.

BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

3.1 Waktu dan Tempat Penelitian

            Praktikum ini dilaksanakan pada hari Jum’at, tanggal 02 November 2012 pada pukul 13.30-17.00 WIB, yang bertempat di Laboratorium Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan, Jurusan Biologi, Universitas Sriwijaya, Inderalaya.

3.2   Alat dan Bahan

Alat yang digunakan dalam percobaan ini adalah tabung reaksi, pipet, spektrofotometer, stopwatch, dan batang pengaduk atau vortex. Sedangkan bahan yang dibutuhkan adalah 2% Na₂CO₃ dalam 0,1 N NaOH; 2,7% Natrium kalium Tartrat, 1% CuSO₄ dalam H₂0, 1 N Reagen Folin-Ciocalteu (“reagen Fenol”), standar protein, dan larutan BSA dengan konsentrasi antara 20-200 µm.

3.3   Cara Kerja

Dicampurkan larutan protein standar dan air sehingga volumenya tidak melebihi 1,0 mL.  Dicampurkan pula sampel protein dengan air sehingga volume akhir 1,0 mL.  Ditambahkan 5 mL larutan Biuret yang telah disiapkan ke dalam masing-masing tabung.  Inkubasi secara tepat 10 menit pada suhu kamar. Selang waktu ini amatlah kritis.  Digunakan stopwatch (nyalakan start) ketika menambahkan larutan Biuret pada tabung 2, dan seterusnya. Setelah 10 menit, tambahkan 0,5 mL reagen Fenol ke dalam masing-masing tabung.  Dikocok segera dengan alat vortex atau pengadukan. Inkubasi selama 30 menit pada suhu kamar.  Waktu inkubasi ini dapat dimulai (start) setelah penambahan atau pencampuran reagen Fenol ke dalam tabung terakhir.   Dibaca absorbsinya pada λ = 700 nm dengan alat spektrofotometer dengan menggunakan tabung 1 sebagai blanko.

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Data Hasil Pengamatan

V₂ larutan keseluruhan = 2 ml

M₁ Larutan BSA = 20 ppm

A₁  = 0,543  ; V BSA = 0 ml

A₂  = 0,863  ; V BSA = 0,1 ml

A₃  = 0,749  ; V BSA = 0,2 ml

A₄  = 0,752  ; V BSA = 0,4 ml

A₅  = 0,850  ; V BSA = 0,6 ml

A₆  = 0,825  ; V BSA = 0,8 ml

A₇  = 1,347  ; V BSA = 1,0 ml

A₈  = 1,999  ; V BSA = 0 ml

4.2 Perhitungan

4.2.1 Nilai Konsentrasi M₂

I.  M₁ × V₁ = M₂ × V₂

20 × 0 = M₂ × 2 ml

M₂ =

II. M₁ × V₁ = M₂ × V₂

20 × 0,1 = M₂ × 2 ml

M₂ =

III. M₁ × V₁ = M₂ × V₂

20 × 0,2 = M₂ × 2 ml

M₂ =

IV. M₁ × V₁ = M₂ × V₂

20 × 0,4 = M₂ × 2 ml

M₂ =

V. M₁ × V₁ = M₂ × V₂

20 × 0,6 = M₂ × 2 ml

M₂ =

VI. M₁ × V₁ = M₂ × V₂

20 × 0,8 = M₂ × 2 ml

M₂ =

VII.  M₁ × V₁ = M₂ × V₂

20 × 1,0 = M₂ × 2 ml

M₂ =

VIII. M₁ × V₁ = M₂ × V₂

20 × 0 = M₂ × 2 ml

M₂ =

4.2.2  Tabel 1

No	Tabung	Konsentrasi (ppm)
1	I	0 ppm
2	II	1 ppm
3	III	2 ppm
4	IV	4 ppm
5	V	6 ppm
6	VI	8 ppm
7	VII	10 ppm
8	VIII	0 ppm

4.2.3  Tabel 2

No	Absorbansi	Konsentrasi
1	0,543	0 ppm
2	0,863	1 ppm
3	0,749	2 ppm
4	0,752	4 ppm
5	0,850	6 ppm
6	0,825	8 ppm
7	1,347	10 ppm
8	1,999	0 ppm

4.3  Pembahasan

Spektrofotometri merupakan metode analisis yang didasarkan pada besarnya nilai absorbsi suatu zat terhadap radiasi sinar elektromagnetik. Prinsip kerja spektrofotometri adalah dengan menggunakan spektrofotometer yang pada umumnya terdiri dari unsur-unsur seperti sumber cahaya, monokromator, sel, fotosel, dan detektor. Spektrofotometer adalah alat untuk mengukur transmitansi atau absorbs cahaya (pernyerapan) oleh suatu sampel sebagai fungsi dari panjang gelombang dan dibandingkan dengan standart tertentu. Selain itu juga digunakan untuk mengukur sederetan sampel pada suatu panjang gelombang tunggal. Meskipun ada yang menggunakan sinar rangkap, tetapi peralatan sama seperti sistem sinar tunggal.

Prinsip kerja alat spektrofotometer yaitu cahaya dari sumber cahaya yang masuk ke monokromator dan didispersikan menjadi cahaya monokromatis. Cahaya monokromatis ditransmisikan melalui sel sampel dalam tempat sampel dan jatuh pada detector, kemudian dikonversikan sinyal listrik yang memperkuat dan tercatat pada rekorder.

Sedangkan pada dasarnya analisis secara spektrofotometer dilakukan dengan cara pembentukan cahaya senyawa berwarna dengan pereaksi-pereaksi tertentu dan setiap warna mempunyai intensitas tertentu. Intensitas cahaya yang dihasilkan diukur dengan spektrofotometer.

Dengan mengukur transmitans larutan sampel, dimungkinkan untuk menentukan konsentrasinya dengan menggunakan hukum Lambert-Beer. Spektrofotometer akan mengukur intensitas cahaya melewati sampel (I), dan membandingkan ke intensitas cahaya sebelum melewati sampel (Io). Rasio disebut transmittance, dan biasanya dinyatakan dalam persentase (%T) sehingga bisa dihitung besar absorban (A) dengan rumus A = -log %T.

Pada percobaan ini digunakan telur ayam kampung. Hal ini disebabkan karena telur ayam kampung yang asli mempunyai kelebihan protein yang tinggi  dibandingkan telur ayam yang lain, sehingga memudahkan dalam pengujian protein. Analisis kimia pada dasarnya terbagi menjadi dua pekerjaan utama yang dikenal dengan analisis secara kualitatif dan analisis kuantitatif. Analisis kualitatif adalah pekerjaan yang bertujuan untuk mengetahui senyawa-senyawa yang terkandung dalam sampel uji. Contohnya pengamatan perubahan warna larutan sampel pada tabung reaksi. Analisis kuantitatif adalah pekerjaan yang bertujuan untuk mengetahui kadar suatu senyawa dalam sampel. Contohnya perhitungan konsentrasi.

Reaksi Biuret merupakan reaksi atau metode yang digunakan untuk mengetahui atau membuktikan keberadaan ikatan peptida pada suatu larutan. Keberadaan ikatan peptida ini menunjukkan bahwa larutan tersebut mengandung salah satu sumber energi bagi tubuh yaitu protein. Perubahan warna ungu pada larutan putih telur menunjukkan larutan tersebut mengandung protein. Pada masing-masing tabung, mengalami perubahan warna menjadi biru setelah ditetesi biuret. Semakin pekat warna biru, semakin tinggi pula kadar protein yang dikandungnya.

BAB V

KESIMPULAN

            Berdasarkan praktikum yang kami lakukan, dapat disimpulkan beberapa hal, yaitu :

1.        Bahan makanan yang mengandung protein jika ditetesi dengan larutan biuret akan berubah wana menjadi ungu.

2.        Semakin pekat warna biru, semakin tinggi pula kadar protein dalam bahan makanan tersebut.

3.        Larutan biuret merupakan reaksi atau metode yang digunakan untuk mengetahui atau membuktikan keberadaan ikatan peptida pada suatu larutan.

4.        Digunakan telur ayam kampung karena telur ayam kampung mempunyai kelebihan protein yang tinggi  dibandingkan telur ayam yang lain, sehingga memudahkan dalam pengujian protein.

5.        Larutan BSA digunakan sebagai sampel umum yang biasa digunakan dalam pengujian protein.

DAFTAR PUSTAKA

Anwar, F. 1992. Penetapan Zat Gizi Dalam Makanan. Bogor: IPB 

Hermansyah, dkk. 2012. Penuntun Praktikum Biokimia. Inderalaya: MIPA UNSRI

Kristiani. 2010. Petunjuk Praktikum Kimia. Salatiga: UKSW

Lehninger. 1998. Dasar Biokimia Jilid 1. Jakarta: Erlangga

Poedjiadi, Anna. 2007.  Dasar Biokimia. Jakarta: UI Press

Soeharsono. 2006. Biokimia 1. Yogyakarta: UGM Press

Sudarmaji. 1996. Analisa Bahan. Yogyakarta: Liberty