Isolasi dan Penentuan Konsentrasi DNA

BAB I

PENDAHULUAN

1.1  Latar Belakang

DNA adalah rantai double heliks berpilin yang terdiri atas polunikleotida, yang berfungsi sebagai perawis sifat dan sintesis protein. DNA terdiri dari dua polimer panjang unit sederhana yang disebut nukleotida, dengan tulang punggung yang terbuat dari gula dan gugus fosfat bergabung dengan ikatan ester.

Metode isolasi dilakukan untuk memisahkan DNA dengan komponen lain dari sel seperti protein, glukosa, air dan lain sebagainya. Isolasi DNA merupakan langkah mempelajari DNA. Salah satu prinsip isolasi DNA yaitu dengan sentrifugasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Tahapan yang dilakukan dalam pemisahan ini yaitu pemecahan sel, pengeluaran DNA dari nukleus dan pengendapan DNA. Pemecahan sel dapat dilakukan secara fisik maupun kimiawi. Pada sel tumbuhan, digunakan detergen untuk mendegradasi dinding selnya. Pada metode ini, digunakan NaCl untuk memekatkan warna DNA, kloroform untuk memisahkan DNA dengan protein, buffer sebagai larutan penyangga dan etanol untuk mengendapkan DNA (Bambang 2007: 121).

Pada percobaan kali ini digunakan hati ayam dan pepaya sebagai sampel. Digunakan sampel ini karena hati ayam dan pepaya memiliki kandungan DNA yang banyak dan enzim DNAase yang sedikit serta mudah untuk dihaluskan. DNAase mempengaruhi jumlah dari DNA.

1.2  Rumusan Masalah

Apa yang dimaksud dengan metode pengendapan pelarut etanol, bagaimana langkah-langkah metode pengendapan pelarut etanol serta apa perbedaan antara mengisolasi DNAdari hati ayam dan buah-buahan.

1.3  Tujuan Percobaan

Dari percobaan ini diharapkan mahasiswa mampu mengisolasi DNA dari hati ayam dan dari buah-buahan yaitu pepeya dengan metode pengendapan pelarut etanol.

1.4  Manfaat Percobaan

Kita dapat mengetahui apa yang dimaksud dengan isolasi DNA dan mengetahui langkah-langkah isolasi DNA serta mengetahui perbedaan antara isolasi DNA dari hati ayam dan buah pepaya.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

         Preparasi DNA dari sel-sel atau jaringan tanaman yang harus diperhatikan adalah jaringan tanaman diperlakukan terlebih dahulu dalam Nitrogen cair (NO2) dan segera dilakukan penggerusan agar diperoleh ekstrak sel yang halus, kemudian ekstrak sel diperlakukan dengan ekstrak buffer yang dicampur dengan  β–merkaptoethanol (fresh) dan selanjutnya seperti jaringan atau organisme yang lain.

Isolasi DNA diawali dengan perusakan dan atau pembuangan dinding sel, yang dapat dilakukan baik dengan cara mekanis seperti sonikasi, tekanan tinggi, beku-leleh maupun dengan cara enzimatis seperti pemberian lisozim. Langkah berikutnya adalah lisis sel. Bahan-bahan sel yang relatif lunak dapat dengan mudah diresuspensi di dalam medium bufer nonosmotik, sedangkan bahan-bahan yang lebih kasar perlu diperlakukan dengan deterjen yang kuat seperti triton X-100 atau dengan sodium dodesil sulfat (SDS).

Pada eukariot, langkah ini harus disertai dengan perusakan membran nukleus. Setelah sel mengalami lisis, remukan-remukan sel harus dibuang. Biasanya pembuangan remukan sel dilakukan dengan sentrifugasi. Protein yang tersisa dipresipitasi menggunakan fenol atau pelarut organik seperti kloroform untuk kemudian disentrifugasi dan dihancurkan secara enzimatis dengan proteinase. DNA yang telah dibersihkan dari protein dan remukan sel masih tercampur dengan RNA sehingga perlu ditambahkan RNAse untuk membersihkan DNA dari RNA. Molekul DNA yang telah diisolasi tersebut kemudian dimurnikan dengan penambahan amonium asetat dan alkohol atau dengan sentrifugasi (Fatchiyah 2011: 189).

Teknik isolasi DNA tersebut dapat diaplikasikan, baik untuk DNA genomik maupun DNA vektor, khususnya plasmid. Untuk memilih di antara kedua macam molekul DNA ini yang akan diisolasi dapat digunakan dua pendekatan. Pertama, plasmid pada umumnya berada dalam struktur tersier yang sangat kuat atau dikatakan mempunyai bentuk covalently closed circular (CCC), sedangkan DNA kromosom jauh lebih longgar ikatan kedua untainya dan mempunyai nisbah aksial yang sangat tinggi. Perbedaan tersebut menyebabkan DNA plasmid jauh lebih tahan terhadap denaturasi apabila dibandingkan dengan DNA kromosom. Oleh karena itu, aplikasi kondisi denaturasi akan dapat memisahkan DNA plasmid dengan DNA kromosom.

Prinsip-prinsip dalam melakukan isolasi DNA ada 2, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas. Teknik sentrifugasi tersebut dilakukan di dalam sebuah mesin yang bernama mesin sentrifugasi dengan kecepatan yang bervariasi, contohnya 2500 rpm (Suharno 2007: 104).

Pada dasarnya isolasi DNA dapat dilakukan dari berbagai sumber, antara lain organ manusia, darah, daun, daging buah, serangga, kalus, akar batang, daging dan sisik ikan. Pada individu yang sama DNA yang diperoleh dari berbagai sumber akan memiliki jenis jumlah dan ukuran yang sama.  DNA yang diisolasi dari tanaman seringkali terkontaminasi oleh polisakarida dan metabolit sekunder seperti tanin, pigmen, alkaloid dan flavonoid. Sedangkan DNA dari hewan lebih banyak mengandung protein. Salah satu kesulitan isolasi DNA dari tanaman tinggi adalah proses destruksi dinding sel untuk melepaskan isi sel. Hal ini disebabkan karena tanaman memiliki dinding sel yang kuat dan seringkali pada beberapa jenis tanaman, kontaminasi tersebut sulit dipisahkan dari ekstrak asam nukleat. Kehadiran kontaminasi di atas dapat menghambat aktivitas enzim, misalnya DNA tidak sensitif oleh enzim restriksidan menggangu proses amplifikasi DNA dengan PCR. Demikian pula pada hewan yang memiliki kandungan kitin (seperti serangga), memerlukan teknik dan metode khusus untuk menghancurkan sel hingga isi dapat terpisah atau keluar dari sel (Nuraini 2011: 56).

Asam nukleat adalah polinukleotida yang terdiri dari unit-unit mononukleotida, jika unit-unit pembangunnya dioksinukleotida maka asam nukleat itu disebut dioksiribonukleat (DNA) dan jika terdiri dari unit-unit mononukleotida disebut asam ribonukleat (RNA). DNA dan RNA mempunyai sejumlah sifat kimia dan fisika yang sama sebab antara unit-unit mononukleotida terdapat ikatan yang sama yaitu melalui jembatan fosfodiester antara posisi 3′ suatu mononukleotida dan posisi 5′ pada mononukleotida lainnya.

Asam-asam nukleat seperti asam deoksiribosa nukleat (DNA) dan asam ribonukleat (RNA) memberikan dasar kimia bagi pemindahan keterangan di dalam semua sel. Asam nukleat merupakan molekul makro yang memberi keterangan tiap asam nukleat mempunyai urutan nukleotida yang unik sama seperti urutan asam amino yang unik dari suatu protein tertentu karena asam nukleat merupakan rantai polimer yang tersusun dari satuan monomer yang disebut nukleotida.

DNA terdiri atas dua untai yang berpilin membentuk struktur heliks ganda. Pada struktur heliks ganda, orientasi rantai nukleotida pada satu untai berlawanan dengan orientasi nukleotida untai lainnya. Hal ini disebut sebagai antiparalel. Masing-masing untai terdiri dari rangka utama, sebagai struktur utama, dan basa nitrogen, yang berinteraksi dengan untai DNA satunya pada heliks. Kedua untai pada heliks ganda DNA disatukan oleh ikatan hidrogen antara basa-basa yang terdapat pada kedua untai tersebut. Empat basa yang ditemukan pada DNA adalah adenin (dilambangkan A), sitosin (C, dari cytosine), guanin (G), dan timin (T). Adenin berikatan hidrogen dengan timin, sedangkan guanin berikatan dengan sitosin (Pratiwi 2007: 79).

Satuan terkecil dari makhluk hidup adalah sel. Segala aktivitas sel diatur oleh inti sel (nukleus). Di dalam inti, terkandung substansi genetik yang terdapat dalam kromosom. Kromosom tersusun atas DNA yang berkondensasi bersama protein histon  di dalam inti sel, membentuk struktur bernama  nukleosom. DNA (deoxyribonucleic acid) atau asam deoksiriboneukleat merupakan substansi
pembawa pembentuk nukleosom. Nukleosom-nukleosom berkelompok dan membentuk benang yang lebih kompak, yang dinamakan benang kromatin.

Benang kromatin ini ditemukan di dalam inti sel. Ketika sel akan membelah, benang kromatin membentuk pilinan yang semakin padat sehingga dapat terlihat menggunakan mikroskop. Struktur yang dihasilkan oleh pengompakan benang kromatin tersebut dikenal sebagai  kromosom. Sebelum sel membelah, molekul DNA dari setiap kromosom berduplikasi sehingga terbentuk lengan kromosom ganda yang disebut  kromatid. Pada kromosom terdapat suatu daerah terang yang tidak mengandung gen, dinamakan sentromer. Bagian ini memiliki peranan sangat penting pada proses pembelahan sel.  Di bagian inilah benang gelendong menempel untuk bagian kromosom pada masing-masing kutub pembelahan yang berlawanan (Srikini 2008: 92).

BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

3.1 Waktu dan Tempat Penelitian

            Praktikum ini dilaksanakan pada hari Senin, tanggal 12 November 2012 pada pukul 13.30-17.00 WIB, yang bertempat di Laboratorium Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan, Jurusan Kimia, Universitas Sriwijaya, Inderalaya.

3.2  Alat dan Bahan

Alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah batang pengaduk, beker gelas 100 mL, blender, corong, garpu, gelas ukur 50 mL, kertas saring, dan tabung reaksi. Sedangkan bahan yang digunakan adalah buah kiwi, bufer garam faal, detergen, etanol absolut, eter,  hati sapi, kloroform-amil alkohol, dan NaCl.

3.3 Cara Kerja

3.3.1. Isolasi DNA dari hati ayam

Sebanyak 5 gram hati ayam dicincang menjadi bagian-bagian yang halus. Dihancurkan dengan mortal dalam 50 ml buffer garam faal selama satu menit. Sentrifugasi suspensi pada kecepatan 5000 rpm selama 15 menit, buang supernatan dan suspensikan kembali endapan dengan 2 mol/L. Dibersihkan endapan, angkat endapan fibrous. Lalu dilarutkan deoksiribonukleoprotein 20 mL NaCl 2 mol/L. Ditambahkan larutan kloroform, campur dan blender selama 30 detik. Sentrifugasi lagi selama 5 menit. Kumpulkan supernatan dan endapan fibrous, pisahkan DNA dan air dengan etanol.

3.3.2. Isolasi DNA dari buah pepaya

Dipotong buah pepaya dan haluskan dengan garpu dalam gelas kimia. Ditambahkan 3 gram NaCl dan 10 mL detergen dan aduk. Didiamkan cairan beberapa menit lalu dipindahkan dalam tabung reaksi. Ditambahkan 9 ml larutan etanol dingin, biarkan selama beberapa menit sampai terbentuk lapisan DNA berupa gelatin putih. Dililitkan DNA pada batang pengaduk dan larutkan dalam air.